Espectrofotometria

Os métodos fotométricos compreendem os métodos analíticos baseados na medida da energia radiante transmitida pelas soluções, emitidas pelas soluções fluorescentes ou, transmitidas ou refletidas pelas suspensões.

A energia radiante é formada de radiações eletromagnéticas com comprimento de onda ou freqüência, que cobrem uma extensa faixa que constitui o espectro eletromagnético total.

Regiões espectrais

- Ultravioleta (UV) = 200 < < 380-400 nm

- Visível (Vis) = 380-400 nm < < 700-800 nm

- Infravermelho (IF) = 800 nm < < 3300 nm

Espectro visível – cores

Uma solução se apresenta corada quando absorve radiações cujos comprimentos de onda se situam na região visível do espectro. Assim, uma solução, na mistura de todas as cores menos a amarela, se apresenta como tal por absorver as radiações do espectro visível com exceção daquelas de comprimento de onda correspondentes a porção do amarelo. Em outros termos, a coloração de um meio é complementar à da luz absorvente. Nem todas as cores são absorvidas igualmente, a cor mais absorvida é a cor complementar.

Os instrumentos que utilizam a medida da absorção e energia radiante por soluções e que tem maior aplicação em laboratório clínico são:

1- Colorímetro: aparelhos que se utilizam de filtros compostos para selecionar porções o espectro a serem utilizadas como cromadores.

2- Espectrofotômetros: aparelhos que se utilizam de redes de difração ou prima-filtro na seção da porção desejada do espectro com cromadores.

Conceitos:

- Luz: forma de energia radiante que se propaga através de ondas, cujo comprimento determina sua cor.

- Luz Policromática: luz branca emitida pelo sol ou pelas lâmpadas de incandescência que contém todos os comprimentos de onda visíveis.

- Luz Monocromática: é o resultado da passagem de luz branca por um monocromador, e que contém apenas uma faixa de comprimento de onda, sendo caracterizada por apresentar cor.

- Cor: resultado do fenômeno físico a absorção da luz.

Fonte: Apostila Fundamentos da Patologia Clínica

Espectrofotômetro

O espectrofotômetro é empregado para medir a quantidade de luz que uma amostra absorve ou a quantidade de luz que é transmitida através da solução quando se incide luz sobre a mesma. O princípio da espectrofotometria é passar um feixe de luz através da amostra e medir a intensidade da luz que atinge o detector. Portanto, espectrofotômetros em geral, são instrumentos compostos por um conjunto de componentes do seguinte tipo: uma fonte de radiação eletromagnética, um conjunto de componentes ópticos que levam esta radiação até a amostra, um compartimento de amostra e um ou mais detectores que medem a intensidade de radiação emitida.

Segue abaixo o esquema de um espectrofotômetro.

a. Luz – Fonte de energia radiante capaz de emitir uma mistura de comprimento de onda

b. Fenda de entrada

c. Prisma óptico

d. Fenda de saída

b + c + d = Monocromador usado para isolamento da porção desejada do espectro

e. Porta cubeta – recipiente onde se coloca a cubeta contendo a solução a ser medida

f. Detector – utilizado para receber a energia radiante transmitida através da solução e transformá-la em energia elétrica

g. Circuito medidor ou Galvanômetro – recebe energia elétrica emitida pelo detector apresentando-a ao operador sob uma forma útil de medida.

Tipos de componentes

* Fontes de Energia Radiante:

- Lâmpada de tungstênio: utilizada para região UV próximo e visível

- Lâmpada de deutério: utilizada para a região do UV

- Lâmpada de xenônio: utilizada para a região do IV

* Monocromadores:

- Filtros de vidro: transmite faixa ampla de comprimento de onda

- Prismas: transmite pequena faixa de onda

- Redes de difração: transmite pequena faixa de comprimento de onda

* Cubetas:

- Vidro: utilizada para a região do visível

- Quartzo: usada para a região do UV

- Plástico: usada para a região do visível e UV

- Detectores: Foto células ou Foto multiplicadores

Lei de Lambert-Beer

Quando uma radiação monocromática passa através de uma solução, ,uma parte da energia é absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é transmitida. Através da espectrofotometria, podemos verificar duas grandezas:

1- Transmitância: quantidade de energia radiante transmitida pela solução. A transmitância é dada pela relação entra a intensidade da radiação transmitida (I) e a intensidade da radiação incidente (Io), ou seja, T = I/Io. Seu valor varia de zero a 1 (ou 0 a 100%), sendo que, quando T=O, toda a luz incidente é absorvida (I=O); quando T=1 toda a luz incideente é transmitida (I=o).

2- Absorbância: quantidade de energia radiante absorvida pela solução. A absorbância ou densidade óptica (DO) é diretamente proporcional à concentração da amostra. Para se determinar a concentração de uma determinada solução, geralmente utiliza-se um Fator de Proporcionalidade (ou Fator de Calibração), o qual é obtido através da relação entre a concentração e a absorbância de uma solução padrão de concentração exatamente conhecida (no caso de uma análise bioquímica, a solução padrão vem juntamente com o kit industrializado comprado, e sua concentração vem impressa no rótulo).

Uma vez conhecido o Fator de proporcionalidade, fica fácil se descobrir a concentração da solução teste. Basta realizar a seguinte equação:

[solução teste] = F x absorbância da solução teste

Exemplo: Determinação da [Hb] de uma amostra.
[padrão] = 13,6 g/dL
abs. padrão = 0,412
abs. amostra = 0,390



Realização de Análise Bioquímica Manual por Espectrofotometria (Colorimetria)

Para se realizar qualquer análise colorimétrica manual, utiliza-se, no mínimo, 3 tubos de ensaio:

- Tubo Branco (B): deverá conter apenas o reagente de uso (cromógeno ou reagente de cor) utilizado para a reação. Esse tubo tem a finalidade de “zerar” o aparelho, e deve ser o primeiro a passar pelo aparelho.

- Tubo Padrão (P): deverá conter o reagente de uso e o padrão (do kit). A reação que ocorrerá entre esses dos reagentes deverá obter um resultado de absorbância e concentração conhecidos. Esse tubo serve para se obter um Fator de Calibração, além de servir como um meio de se saber se a pipetagem dos reagentes está sendo feita corretamente.

- Tubo Teste (T): deverá conter o reagente de uso e a amostra a ser analisada. A absorbância obtida através dessa análise deverá ser multiplicada pelo Fator obtido, afim de se obter a concentração final da mesma.

Unidades de Medida

As três principais grandezas físicas são: massa (medida em gramas), espaço (medido em metros) e tempo (medido em horas). Os múltiplos e submúltiplos do padrão são indicados por prefixos. Os principais prefixos utilizados são:

Exercício:

Converta os valores abaixo:

a) 0,20 kg em g =
b) 100 mL em litro =
c) 200 mg em decagramas =
d) 50 mL em μL =
e) 10-3 kg em g =
f) 5,0.102 mg em cg =
g) 54 μg em g =
h) 98 μl em L =
i) 1000 mL em L =
j) 100 mg/dL em μg/dL =
k) 2,45 g/100mL em cg/dL =
l) 34 g/dL em g/L =
m) 0,245 g/L em mg/mL =
n) 98,5 cg/L em mg/L =
o) 67 g/dL em mg/L =
p) 34 μg/L em g/dL =
q) 22 μg/mL em g/L =
r) 0,00015 kg/ml em g/ dl =
s) 4,8 mg/10mL em g/L =

Eritron

O termo eritron define a massa total de eritrócitos circulantes associado ao tecido eritropoiético da medula óssea. Os métodos para a avaliação do estado funcional do eritron são a contagem total de hemácias; a avaliação do teor de hemoglobina e a determinação do hematócrito. Estes três valores, por sua vez, são utilizados para o cálculo dos Índices Hematimétricos ou seja, o Volume Globular Médio (VGM), a Hemoglobina Globular Média (HGM) e a Concentração da Hemoglobina Globular Média (CHGM). Tais índices são utilizados para a elucidação das alterações do eritron, especialmente na avaliação dos tipos de anemia.

Eritrograma

É a avaliação dos eritrócitos, do hematócrito e da hemoglobina, assim como a contagem e avaliação dos reticulócitos, nos casos necessários.

Contagem total de eritrócitos

Para a realização da contagem total de eritrócitos podem ser utilizados vários métodos, que são divididos em manuais e automáticos. O método manual utilizado é o método do hemocitômetro ou seja, a Câmara de Neubauer. As contagens automáticas são realizadas através de aparelhos fotoelétricos, eletrônicos ou a lazer.

*Hemocitômetro: Utilizado quando em pequenos laboratórios, onde o volume de serviços não justifica a compra de um aparelho para a contagem por métodos automáticos. Este método apresenta erros de até 20%.

*Automáticos: Utilizados em grandes laboratórios, onde o volume de exames justifica a compra de um aparelho destes. Podem ser fotoelétricos, que medem a quantidade de luz que é transmitida através de uma suspensão de hemácias; eletrônicos, quando as hemácias são diluídas em uma solução eletrolítica e passadas por uma abertura, que apresenta certa resistência elétrica. A alteração na freqüência elétrica é igual ao número de células. Nos aparelhos a laser a difração da luz incidida sobre as células faz a contagem, baseada no tamanho e complexidade interna de cada uma. Estes métodos apresentam erros de até 5%.

Vidrarias e Acessórios Laboratoriais

         O vidro foi escolhido entre outros materiais em virtude de suas características físicoquímicas muito favoráveis a sua utilização em laboratório, porque além de não apresentar porosidades, não permitindo que sujeira fique aderida, também mostra-se inerte a inúmeros reagentes, não sendo corroído, ou contaminando a mostra. Apresenta ainda a virtude de sua transparência quando desejada ou ainda sua pigmentação, quando se faz necessário a proteção da substância dos efeitos da luz.

        Além destas qualidades, o vidro também apresenta grande estabilidade em sua forma, não sofrendo alteração no tamanho, durante sua vida útil e ainda, em algumas espécies, permite seu aquecimento.

Tipos e Classificações

Com toda esta variedade de características do elemento vidro, devemos classificar as vidrarias utilizadas em laboratório, a fim de evitarmos a utilização inadequada do instrumento. As classificações básicas das vidrarias em geral é a seguinte:
• Resistência ao calor

 - Vidrarias refratárias: quando podemos aquecer o vidro. Geralmente possuem indicações como “Pirex”, “Pirobras” ou outras, impressas no vidro. Exs.: balão de fundo chato e de fundo redondo, becker, cadinho, cápsula de porcelana, erlenmeyer, tubo de ensaio etc.
- Vidrarias não refratárias: quando não podemos aquecê-las. Se aquecidas, fatalmente se quebram, podendo ocasionar sérios acidentes. Exs.: funis em geral, vidro de relógio, bastão de vidro, lâminas, lamínulas etc.
• Precisão:
- Vidrarias de precisão: possuem graduação (permite a medida do volume interno de líquido), capacidade e temperatura de aferição (quando fabricada, sua capacidade volumétrica é medida a exatos 20°C, o que permite a confiabilidade volumétrica quando manipulada à esta mesma temperatura). Exs.: proveta graduada, pipeta volumétrica, pipeta graduada, bureta, pipeta de Sahli etc.
- Vidrarias de semi-precisão: apresentam somente o volume aproximado, indicando sua margem de erro que pode ser de 10% ou 5%. Ex.: becker, balão volumétrico.
- Vidrarias de não-precisão: não apresentam escala nem margem de erro. Exs.: balão de fundo chato e de fundo redondo, vidro de relógio. As vidrarias de precisão nunca devem ser aquecidas, pois perdem sua precisão em virtude da dilatação sofrida pelo vidro durante o processo de aquecimento.
Existem também outras vidrarias amplamente utilizadas em laboratório, que não acondicionam volumes de líquidos, as quais são: lâminas, lamínulas, bastão de vidro etc.

Seguem alguns desenhos das principais vidrarias e acessórios utilizados em laboratório:

PRINCIPAIS VIDRARIAS E ACESSÓRIOS LABORATORIAIS

- Anel para funil: usado como suporte de funis.
- Alça de platina: usada basicamente em microbiologia. Pode ser usada para outros fins.
- Lâmina: usada por vários setores técnicos e para diversos fins.
- Lamínula: usada por vários setores e para diversos fins.
- Câmara de Neubauer: usada para contagem global de células vermelhas e brancas; usada em sedimentoscopia urinária.
- Balão de destilação: usado em destilações. Possui saída lateral para condensação de vapores.
- Balão de fundo chato: usado para aquecimento e armazenamento de líquidos.
- Balão de fundo redondo: usado para aquecimento de líquidos e reações de desprendimento de gases.
- Balão volumétrico: usado para preparar e diluir soluções.
- Becker: usado para aquecimento de líquidos, reações de precipitação etc.
- Bico de Bunsen: usado para aquecimentos de laboratório.
- Bureta: usada para medidas precisas de líquidos. Usada em análises volumétricas.
- Capilares: tubos de diâmetro reduzido usados em micropesquisas. São usados também em hematologia (hematócrito) e bacteriologia.
- Condensador: usados para condensar os gases ou vapores na destilação.
- Dessecador: usado para resfriar substâncias em ausência de umidade.
- Erlenmeyer: usado para titulações e aquecimento de líquidos.
- Escovas: usadas para limpeza de tubos de ensaio e outros materiais.
- Estante para tubos de ensaio: suporte de tubos de ensaio.
- Frasco de reagentes: usado para o armazenamento de soluções.
- Funil de Buchner: usado em conjunto com o Kitassato para filtração a vácuo.
- Funil de haste longa: usado em transferências de líquidos e em filtrações de laboratório.
- Funil de separação / decantação: usado para separação de líquidos imiscíveis.
- Garra metálica: usadas em filtrações, sustentação de peças tais como condensador, funil de decantação e outros fins.
- Kitassato: usado para filtração a vácuo.
- Pinça de madeira: usada para segurar tubos de ensaio durante aquecimentos diretos no bico de Bunsen.
- Pinça de Mohr e Pinça de Hoffman: usadas para impedir ou diminuir fluxos gasosos.
- Pinça metálica: usada para transporte de cadinhos e outros fins.
- Pipeta de Pasteur: usada para a transferência de líquidos.
- Pipeta de Sahli: usada na dosagem de hemoglobina sangüínea.
- Pipeta de Thoma: usada para medir a quantidade de células sangüíneas.
- Pipeta de Westergreen: usada na determinação da velocidade de hemossedimentação.
- Pipeta graduada: usada para medir volumes variáveis de líquidos.
- Pipeta volumétrica: para medir volumes fixos de líquidos.
- Pisseta: usada para lavagens, desinfeção, remoção de precipitados e outros fins.
- Placa de Petri: usada para fins diversos.
- Proveta graduada: usada para medidas aproximadas de volumes de líquidos.
- Termômetro: usado para a medida de temperaturas.
- Tubo cônico: usados em pesquisas bacteriológicas, sedimentoscopia urinária, pesquisas parasitológicas e bioquímica.
- Tubo de Ensaio: usado em reações químicas, principalmente testes de reação.
- Tubo de Wintrobe: usada na determinação do volume celular sangüíneo – hematócrito.
- Vidro de relógio: usado para cobrir beckers em evaporações, pesagens e fins diversos.

fonte: Apostila de Fundamentos de Patologia Clínica