Espectrofotometria

Os métodos fotométricos compreendem os métodos analíticos baseados na medida da energia radiante transmitida pelas soluções, emitidas pelas soluções fluorescentes ou, transmitidas ou refletidas pelas suspensões.

A energia radiante é formada de radiações eletromagnéticas com comprimento de onda ou freqüência, que cobrem uma extensa faixa que constitui o espectro eletromagnético total.

Regiões espectrais

- Ultravioleta (UV) = 200 < < 380-400 nm

- Visível (Vis) = 380-400 nm < < 700-800 nm

- Infravermelho (IF) = 800 nm < < 3300 nm

Espectro visível – cores

Uma solução se apresenta corada quando absorve radiações cujos comprimentos de onda se situam na região visível do espectro. Assim, uma solução, na mistura de todas as cores menos a amarela, se apresenta como tal por absorver as radiações do espectro visível com exceção daquelas de comprimento de onda correspondentes a porção do amarelo. Em outros termos, a coloração de um meio é complementar à da luz absorvente. Nem todas as cores são absorvidas igualmente, a cor mais absorvida é a cor complementar.

Os instrumentos que utilizam a medida da absorção e energia radiante por soluções e que tem maior aplicação em laboratório clínico são:

1- Colorímetro: aparelhos que se utilizam de filtros compostos para selecionar porções o espectro a serem utilizadas como cromadores.

2- Espectrofotômetros: aparelhos que se utilizam de redes de difração ou prima-filtro na seção da porção desejada do espectro com cromadores.

Conceitos:

- Luz: forma de energia radiante que se propaga através de ondas, cujo comprimento determina sua cor.

- Luz Policromática: luz branca emitida pelo sol ou pelas lâmpadas de incandescência que contém todos os comprimentos de onda visíveis.

- Luz Monocromática: é o resultado da passagem de luz branca por um monocromador, e que contém apenas uma faixa de comprimento de onda, sendo caracterizada por apresentar cor.

- Cor: resultado do fenômeno físico a absorção da luz.

Fonte: Apostila Fundamentos da Patologia Clínica

Espectrofotômetro

O espectrofotômetro é empregado para medir a quantidade de luz que uma amostra absorve ou a quantidade de luz que é transmitida através da solução quando se incide luz sobre a mesma. O princípio da espectrofotometria é passar um feixe de luz através da amostra e medir a intensidade da luz que atinge o detector. Portanto, espectrofotômetros em geral, são instrumentos compostos por um conjunto de componentes do seguinte tipo: uma fonte de radiação eletromagnética, um conjunto de componentes ópticos que levam esta radiação até a amostra, um compartimento de amostra e um ou mais detectores que medem a intensidade de radiação emitida.

Segue abaixo o esquema de um espectrofotômetro.

a. Luz – Fonte de energia radiante capaz de emitir uma mistura de comprimento de onda

b. Fenda de entrada

c. Prisma óptico

d. Fenda de saída

b + c + d = Monocromador usado para isolamento da porção desejada do espectro

e. Porta cubeta – recipiente onde se coloca a cubeta contendo a solução a ser medida

f. Detector – utilizado para receber a energia radiante transmitida através da solução e transformá-la em energia elétrica

g. Circuito medidor ou Galvanômetro – recebe energia elétrica emitida pelo detector apresentando-a ao operador sob uma forma útil de medida.

Tipos de componentes

* Fontes de Energia Radiante:

- Lâmpada de tungstênio: utilizada para região UV próximo e visível

- Lâmpada de deutério: utilizada para a região do UV

- Lâmpada de xenônio: utilizada para a região do IV

* Monocromadores:

- Filtros de vidro: transmite faixa ampla de comprimento de onda

- Prismas: transmite pequena faixa de onda

- Redes de difração: transmite pequena faixa de comprimento de onda

* Cubetas:

- Vidro: utilizada para a região do visível

- Quartzo: usada para a região do UV

- Plástico: usada para a região do visível e UV

- Detectores: Foto células ou Foto multiplicadores

Lei de Lambert-Beer

Quando uma radiação monocromática passa através de uma solução, ,uma parte da energia é absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é transmitida. Através da espectrofotometria, podemos verificar duas grandezas:

1- Transmitância: quantidade de energia radiante transmitida pela solução. A transmitância é dada pela relação entra a intensidade da radiação transmitida (I) e a intensidade da radiação incidente (Io), ou seja, T = I/Io. Seu valor varia de zero a 1 (ou 0 a 100%), sendo que, quando T=O, toda a luz incidente é absorvida (I=O); quando T=1 toda a luz incideente é transmitida (I=o).

2- Absorbância: quantidade de energia radiante absorvida pela solução. A absorbância ou densidade óptica (DO) é diretamente proporcional à concentração da amostra. Para se determinar a concentração de uma determinada solução, geralmente utiliza-se um Fator de Proporcionalidade (ou Fator de Calibração), o qual é obtido através da relação entre a concentração e a absorbância de uma solução padrão de concentração exatamente conhecida (no caso de uma análise bioquímica, a solução padrão vem juntamente com o kit industrializado comprado, e sua concentração vem impressa no rótulo).

Uma vez conhecido o Fator de proporcionalidade, fica fácil se descobrir a concentração da solução teste. Basta realizar a seguinte equação:

[solução teste] = F x absorbância da solução teste

Exemplo: Determinação da [Hb] de uma amostra.
[padrão] = 13,6 g/dL
abs. padrão = 0,412
abs. amostra = 0,390



Realização de Análise Bioquímica Manual por Espectrofotometria (Colorimetria)

Para se realizar qualquer análise colorimétrica manual, utiliza-se, no mínimo, 3 tubos de ensaio:

- Tubo Branco (B): deverá conter apenas o reagente de uso (cromógeno ou reagente de cor) utilizado para a reação. Esse tubo tem a finalidade de “zerar” o aparelho, e deve ser o primeiro a passar pelo aparelho.

- Tubo Padrão (P): deverá conter o reagente de uso e o padrão (do kit). A reação que ocorrerá entre esses dos reagentes deverá obter um resultado de absorbância e concentração conhecidos. Esse tubo serve para se obter um Fator de Calibração, além de servir como um meio de se saber se a pipetagem dos reagentes está sendo feita corretamente.

- Tubo Teste (T): deverá conter o reagente de uso e a amostra a ser analisada. A absorbância obtida através dessa análise deverá ser multiplicada pelo Fator obtido, afim de se obter a concentração final da mesma.